蛋白二硫键异构酶A6（PDIA6）按捺太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）血细胞热诱导氧化危害

  热应激导致海洋双壳类动物严峻的氧化危害及免疫细胞逝世，但其上游调控因子尚不清晰。本研讨旨在判定衔接太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）血细胞热应激与氧化危害的调控因子。在30 °C露出下，牡蛎血细胞凋亡率从约4.54%添加至24小不时的17.40%

  热应激导致海洋双壳类动物严峻的氧化危害及免疫细胞逝世，但其上游调控因子尚不清晰。本研讨旨在判定衔接太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）血细胞热应激与氧化危害的调控因子。在30 °C露出下，牡蛎血细胞凋亡率从约4.54%添加至24小不时的17.40%，随同活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）和脂质氢过氧化物（LPO）升高以及超氧化物歧化酶（SOD）活性下降。对血细胞转录组的基因集富集剖析（GSEA）与蛋白互作剖析确认蛋白二硫键异构酶A6（CgPDIA6）为衔接内质网（ER）应激、凋亡与氧化应激的纽带基因。单细胞计算机模仿敲除将CgPDIA6置于偶联的SOD–过氧化复原蛋白（Peroxiredoxin）中继体系（CgSOD1、CgSOD2、CgPRDX6）之首，并使血细胞转向应激激活状况。该猜测经RNA搅扰（RNAi）敲减证明，缄默沉静CgPDIA6加剧了热诱导氧化危害，下降了抗氧化相关基因（CgSOD1、CgSOD2及CgPRDX6）的表达，并进一步按捺SOD活性。分子动力学模仿显现热量使其催化硫氧还蛋白结构域失稳，危害其维护功用。上述依据成果得出CgPDIA6经过保持抗氧化酶活性维护血细胞免受热诱导氧化危害，为软体动物氧化复原调理与耐热习惯供给了见地。

  全球变暖导致海表温度继续上升，海洋热浪的频率、保持的时刻与强度显着地添加。关于无法行为逃逸的固着日子双壳类软体动物而言，升温损坏蛋白质稳态，引发氧化危害并危害免疫机能，从而导致夏日大规模逝世事情，给全球水产饲养业带来严峻经济损失。在热危害的下流效应中，氧化应激占有中心病理位置。热露出影响线粒体电子传递链功用障碍与呼吸解偶联，引产生ROS迸发，从而压倒内源抗氧化防护体系。由此导致的氧化复原失衡驱动脂质过氧化、蛋白质羰基化及DNA链断裂，终究使应激细胞走向凋亡途径。在双壳类中，热诱导的ROS堆集已被直接证明与血细胞凋亡、SOD活性按捺以及MDA和LPO等氧化危害标志物升高相关。虽然氧化应激在双壳类热病理学中处于中心位置，但将热感知与氧化复原失调耦合的上游分子调控因子仍不清晰。

  ）是一种内质网驻留氧化复原酶，催化二硫键构成，并经过办理内质网腔内的氧化折叠环境操控ER氧化复原稳态。PDIA

  坐落未折叠蛋白反响（UPR）与氧化应激的交叉点，在ER应激下经过与IRE1α的氧化半胱氨酸残基（Cys148）直接结合调理PERK信号，减轻长时刻UPR激活并约束凋亡。PDIA

  缺失则导致继续的IRE1α自磷酸化、过度的XBP1剪接及细胞内ROS堆集。在多种无脊椎动物中，PDIA

  在热露出下激烈上调，暗示其在和谐热应激的抗氧化与蛋白稳态反响中具有保存效果。但是，双壳类免疫细胞中PDIA

  太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）是全球饲养最广的双壳类，也是研讨环境应激习惯的经典模型。跟着全球变暖加剧海洋热浪，热诱导的大规模逝世成为牡蛎饲养的首要约束要素，其间作为首要免疫细胞的血细胞尤为易受氧化危害。说明牡蛎血细胞怎么样应对热诱导氧化应激关于处理这一可靠至关重要。本研讨评论PDIA

  如安在热应激下和谐牡蛎血细胞的抗氧化防护，为海洋无脊椎动物氧化复原调理供给新见地，并为耐热育种供给候选靶点。本论文发表于《Antioxidants》。

  研讨人员收集我国辽宁大连认证饲养场的成年C. gigas（壳长8±2 cm，n=200）作为样本行列，经16±1 °C驯化后用于试验。首要技能包含：30 °C热应激处理结合流式细胞术检测凋亡及商业化试剂盒检测ROS、SOD、MDA、LPO等氧化应激目标；血细胞转录组测序（Illumina NovaSeq 6000）结合DESeq2进行差异表达基因（DEG）剖析、GSEA及KEGG富集剖析；根据STRING与Cytoscape构建蛋白互作（PPI）网络并辨认纽带基因；CgPDIA

  序列与结构剖析（SMART、AlphaFold3、PyMOL）及根据邻接法的体系发育树构建（MEGA 11）；使用Seurat与Monocle3对单细胞RNA-seq数据进行聚类与轨道剖析并进行计算机模仿（in silico）敲除；经过RNase III缺点型大肠杆菌HT115（DE3）制备dsRNA并进行RNAi体内敲减结合qRT-PCR验证功率；使用GROMACS（AMBER99SB-ILDN力场、TIP3P水模型）在16 °C（289.15 K）与30 °C（303.15 K）下进行100 ns分子动力学（MD）模仿并剖析RMSD、RMSF、Rg及SASA与自由能景象。

  3.1. Heat Stress Induces Oxidative Damage and Time-Dependent Apoptosis in C. gigas Haemocytes

  30 °C露出引发C. gigas血细胞和谐性促氧化改动。与16 °C对照比较，30 °C露出24小时显着地添加了胞内LPO与ROS及MDA（p

  3.2. Transcriptomic Profiling Identifies PDIA6 as the Central Hub Linking ER Stress, Apoptosis, and Oxidative Stress

  是最强上调转录本之一。GSEA将凋亡通路列为最高（NES = 1.62，校对p = 0.04），KEGG富集将内质网蛋白加工列为顶通路，直接衔接ER蛋白稳态与热呼应。联合前100高置信度DEG、前20 GSEA前沿基因及前10 KEGG一切基因构建PPI网络，CgPDIA

  以最高节点度、介数中心性及共表达相关性成为中枢，直接与ERO1B、PERK、HSP70、HSPA4、DNAJC3、GPX2-like、HYOU1互作，被确认为整合ER应激、凋亡与氧化应激的中心节点。

  3.3. Molecular Characterization, Phylogeny, and Tissue/Developmental Transcript Expression of CgPDIA6

  蛋白含两个串联硫氧还蛋白（thioredoxin, TRX）结构域，具PDI宗族典型架构。体系发育树中CgPDIA

  转录丰度在血细胞最高（FPKM = 547），并与CgSOD1、CgSOD2、CgGSTA、CgTXNRD2等抗氧化基因和谐表达。发育过程中，前期胚胎低表达，D形幼虫期显着上升并保持至稚贝与幼体期，契合环境露出添加后对ER氧化复原稳态需求上升的形式，支撑其在血细胞中专职抗氧化维护效果。

  3.4. In Silico CgPDIA6 Knockout Exposes a Haemocyte Antioxidant Network

  处于中心节点，直接衔接抗氧化效应子CgSOD1、CgSOD2、CgGPX2、CgPRDX

  、CgFTL及铁与线粒体相关应激蛋白CgPHB2、CgIDH1、CgHSP75、CgHSP60A。猜测血细胞状况从稳态转向应激激活，应激激活效应群（Cluster 12）从24增至83细胞，静息与细胞骨架/发育群（Cluster 0、5）削减。敲除呼应基因KEGG剖析富集细胞变老与相关应激通路，猜测CgPDIA

  3.5. RNAi Knockdown of CgPDIA6 Amplifies Heat-Induced Oxidative Damage

  下降47.7%表达；30 °C热应激下12与24小时下降超60%。敲减加剧热诱导氧化危害：与dsEGFP对照比，dsPDIA

  血细胞在一切时刻点ROS虚怀若谷显着升高，LPO与MDA在24小时差异最大且虚怀若谷显着升高，SOD活性呈下降趋势且在24小时最低。16 °C非应激下两组间LPO、MDA、ROS、SOD无显着差异，标明CgPDIA

  3.6. CgPDIA6 Knockdown Promotes Apoptosis and Alters Antioxidant Responses

  血中低于dsEGFP对照，其间CgSOD2呼应最强，热应激中降幅大于CgSOD1。标明CgPDIA

  3.7. Molecular Dynamics Simulation Reveals Heat-Induced Destabilization of CgPDIA6

  16 °C与30 °C下100 ns MD模仿显现两轨道均达安稳RMSD渠道，回转半径收敛类似，全体折叠保持。但30 °C体系残基动摇更高，特别两个TRX催化结构域（aa 23–127及160–266）内，且溶剂可及表面积更大。自由能景象从16 °C单一窄盆地变为30 °C更宽多阱区。标明热添加CgPDIA

  6部分柔性与构象不安稳性，特别催化域周围，暗示对蛋白功用的去安稳效应。

  评论指出，C. gigas血细胞的双相凋亡反映习惯性应激程序的有限容量：亚致死热先激活生计通路抑凋亡，继续应激后防护被压倒，凋亡24小时达峰，48小时部分回落反映危害细胞铲除而非真实缓解。CgPDIA

  热诱导上调是该习惯性缓冲的一部分，推迟但无法无限避免逝世，该有限缓冲动力在双壳类中保存。峰值凋亡与最大ROS、MDA、LPO及最小SOD同步，建立氧化应激为热凋亡驱动者而非副产物，确认24小时为解析上游操控的要害窗口。

  热应激加快ER蛋白过错折叠，ERO1–PDI折叠循环过载使ER本身成ROS源，将PDIA

  经过结合IRE1α氧化Cys148约束UPR时长、调理PERK信号约束凋亡许诺，差异于纯催化PDI成员，是耦合ER蛋白稳态应激严峻度与生计/凋亡决议的检查点。网络中PDIA

  氧化酶）并共聚类HSP70、HYOU1、DNAJC3等ER伴侣模块，在多物种中保存热诱导，标明该检查点非牡蛎特有而是热应激下蛋白稳态耦合氧化复原防护的进化通用战略。

  安排与发育散布标明其为专职抗氧化因子而非组成型管家酶，富集于最易受热的血细胞而非解毒鳃或消化腺，指向与免疫活动相关的胞内氧化复原人物，并与SOD1、SOD2、GSTA、TXNRD2和谐表达，相关抗氧化呼应。自D形幼虫期急剧上升，对应自动摄食与贝壳构成带来的代谢与折叠负荷及ER抗氧化鏖战需求。散布难以用管家人物解说，标记为血细胞氧化复原稳态的应激呼应守护者。

  坐落该中继上游，其扰动可能会影响该中继。RNAi时刻进程显现敲减后CgSOD1、CgSOD2、CgPRDX

  转录下降支撑相关。氧化目标协同恶化：ROS先升，LPO 24小时达峰，SOD活性自12小时渐降，反映抗氧化容量广泛损坏而非单标志改动，标明CgPDIA

  经过保持级联完整性推迟危害而非消除危害。当时依据源于体系RNAi与转录水平，需靶向细胞办法与蛋白水平验证准确调控。

  需求还直接影响酶本身。100 ns模仿中30 °C下强逼折叠保存（RMSD平稳、Rg收敛），但两TRX域更柔性（高RMSF、大SASA、宽自由能景象），这些域含CgHC催化基序，活性依靠准确活性位点几许，部分柔性添加预期危害催化功率。热因此两层效果：提高需求一起腐蚀每分子催化鏖战。上调为代偿呼应，但热去安稳削弱被发动的酶本身，代偿不完整，维护缓冲终究被逾越。模仿与RNAi互补：敲降示丰度下降加剧危害，MD示热本身降解功用，二者均指向功用性酶残缺。热经过危害CgPDIA

  为衔接太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）血细胞热应激与氧化危害的要害氧化复原维护调控因子。热应激驱动和谐性氧化改动并终究致凋亡，CgPDIA

  作为耦合ER应激、凋亡与氧化应激的中心纽带显现。功用剖析显现CgPDIA

  表达，进一步支撑其在保持氧化复原稳态中的效果。热进一步去安稳CgPDIA

  作为检查点和谐ER应激–氧化应激–凋亡轴，其本身热脆弱性设定了血细胞耐性的上限。这些发现确认CgPDIA

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